Un modelo de ratón neonatal caracteriza la transmisibilidad del SARS

Apr 29, 2023

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3026 (2023) Citar este artículo

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Los modelos de animales pequeños han sido un desafío para el estudio de la transmisión del SARS-CoV-2, y la mayoría de los investigadores utilizan hámsters dorados o hurones. Los ratones tienen las ventajas de bajo costo, amplia disponibilidad, menos desafíos regulatorios y de manejo, y la existencia de una caja de herramientas genética y de reactivos versátil. Sin embargo, los ratones adultos no transmiten con fuerza el SARS-CoV-2. Aquí establecemos un modelo basado en ratones neonatales que permite la transmisión de aislamientos clínicos de SARS-CoV-2. Caracterizamos el tropismo, la replicación del tracto respiratorio y la transmisión de WA-1 ancestral en comparación con las variantes Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2), Omicron BA.1 y Omicron BQ.1.1. Identificamos diferencias entre variantes en el momento y la magnitud del desprendimiento de partículas infecciosas de los ratones índice, que dan forma a la transmisión a los ratones de contacto. Además, caracterizamos dos SARS-CoV-2 recombinantes que carecen de los antagonistas del huésped ORF6 u ORF8. La eliminación de ORF8 cambia la replicación viral hacia el tracto respiratorio inferior, lo que resulta en una transmisión significativamente retrasada y reducida en nuestro modelo. Nuestros resultados demuestran el potencial de nuestro modelo de ratón neonatal para caracterizar los determinantes virales y del huésped de la transmisión del SARS-CoV-2, al tiempo que revelan el papel de una proteína accesoria en este contexto.

A pesar de los esfuerzos de vacunación en todo el mundo y el aumento de la inmunidad natural, las variantes emergentes del SARS-CoV-2 continúan infectando y afectando la salud de millones de personas. Las variantes anteriores de preocupación incluyen Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) y Omicron (B.1.1.529), mientras que Omicron sub- el linaje XBB.1.5 actualmente domina la primera mitad de 20231. Las variantes difieren en genes clave en todo el genoma viral, incluidos Spike (S), ORF1a, ORF1b, Nucleocapsid (N), ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF8, ORF9b, Envelope (E ), y Membrana (M). Se ha prestado mucha atención a los cambios en Spike, ya que esta glicoproteína de la cubierta es el antígeno objetivo de la mayoría de las estrategias de vacunación hasta la fecha2 y es clave para la entrada viral en las células3. Otros puntos críticos clave que acumulan mutaciones en las variantes del SARS-CoV-2 son las proteínas accesorias, de las cuales el SARS-CoV-2 codifica 8, y algunas sirven como antagonistas de la respuesta antiviral del huésped, sobre todo la producción y respuesta del interferón tipo I4,5,6 . Nuestro conocimiento de los ORF de SARS-CoV-2 se deriva de la inferencia de similitudes funcionales con el SARS-CoV-1 y otros coronavirus, así como de estudios funcionales que utilizan construcciones de sobreexpresión de ADNc de ORF o SARS-CoV-27,8,9,10 recombinante completo. El alto número de infecciones por SARS-CoV-2 que coincidieron con la aparición de nuevas variantes generó preocupaciones sobre la transmisión mejorada de estas variantes, lo que plantea ramificaciones considerables para la resolución de la pandemia de COVID-1911.

La caracterización molecular de las variantes del SARS-CoV-2 es esencial para nuestra capacidad de desarrollar estrategias antivirales apropiadas. Estudios anteriores han caracterizado las variantes del SARS-CoV-2 mediante la evaluación de la unión y la afinidad del receptor, el escape antigénico y la dinámica de replicación, así como la patogénesis y la evasión inmunitaria12,13. Sin embargo, los estudios comparativos sobre la transmisión de variantes y los mecanismos moleculares que rigen las diferencias de transmisión específicas de variantes aún son escasos. Esto se debe en parte a las limitaciones inherentes a los modelos animales actuales, como los hurones o los hámsters. Si bien son excelentes modelos para el estudio de la patogénesis y la transmisión del SARS-CoV-214,15,16, requieren un alojamiento especial, el número de animales de contacto por índice es limitado, carecen de reactivos específicos de especie y tienen una disponibilidad limitada o nula de información genética. manipulación para realizar estudios mecanísticos sobre los factores de transmisión del huésped. Por el contrario, los ratones ofrecen una caja de herramientas genéticas versátil y fácilmente disponible, y los reactivos están ampliamente disponibles; sin embargo, los ratones adultos no transmiten eficientemente los virus respiratorios, como los virus de la influenza, a pesar de ser susceptibles a la infección17. Previamente superamos este obstáculo para el virus de la influenza utilizando ratones neonatales17, un modelo que se ha utilizado para estudiar la infección bacteriana durante más de 30 años18,19 y la transmisión durante 7 años17,19,20,21,22. El modelo también ha sido aplicado con éxito por otros para estudiar la transmisión del parvovirus en ratones23. Nuestro estudio anterior reveló diferencias de transmisión específicas de la cepa del virus de la influenza, el papel de la inmunidad humoral en la protección de la transmisión del virus de la influenza y la influencia de la expresión de sialidasa durante la coinfección por el virus de la influenza y Streptococcus pneumoniae17. Sin embargo, el modelo no está establecido para el SARS-CoV-2.

Aquí, presentamos un modelo de ratón K18-hACE2 recién nacido que permite la transmisión de SARS-CoV-2 entre cachorros de la misma camada, y examinamos en paralelo la transmisión de variantes preocupantes tempranas y actuales de SARS-CoV-2 (COV). Además, caracterizamos la transmisión de dos SARS-CoV-2 recombinantes, que carecen de proteínas accesorias ORF6 u ORF8. Nuestro estudio destaca el poder de nuestro modelo para dilucidar la dinámica de la transmisión de la variante SARS-CoV-2 y proporciona evidencia de que una proteína accesoria, ORF8, es fundamental para la transmisión del SARS-CoV-2 en ratones recién nacidos. Nuestro modelo de animal pequeño tratable ayudará a descifrar algunos de los factores más críticos involucrados en la transmisión del SARS-CoV-2.

Si bien los virus de la influenza infectan fácilmente a los ratones de tipo salvaje, el SARS-CoV-2 ancestral y la variante delta clínicamente importante anteriormente se basan en la versión humana del receptor de la célula huésped del SARS-CoV-2, ACE2, y no pueden interactuar con Ace224 murino. Por el contrario, varias otras variantes del SARS-CoV-2 adquirieron mutaciones específicas de Spike, sobre todo N501Y, que les permite unirse a Ace225 murino. En última instancia, nuestro objetivo fue comparar un panel de variantes, desde Alpha hasta Omicron, con el ancestral SARS-CoV-2. Con esto en mente, utilizamos ratones K18-hACE2 en nuestro estudio, que expresan ACE2 humana bajo el control del promotor K1826.

Para SARS-CoV-2, los datos sobre la transmisión en ratones adultos son escasos, y un estudio informó la transmisión de SARS-CoV-2 B.1.351 (Beta) de ratones índice infectados con 5E6 FFU a través de contacto cercano27. La transmisión entre ratones alojados en la misma jaula, determinada por la presencia de ARN viral o la seroconversión de los contactos, fue del 41 y el 8 %, respectivamente. No se evaluó el virus infeccioso. La transmisión de los virus de la influenza en ratones adultos también ha sido ineficiente e inconsistente, y los eventos de transmisión son difíciles de reproducir entre los grupos de investigación17,28,29. Esto convirtió al modelo de ratón adulto en una herramienta poco fiable para estudiar la transmisión de los virus de la gripe. Para determinar la eficiencia de la transmisión del SARS-CoV-2 en ratones adultos en nuestras manos, infectamos ratones índice K18-hACE2 de 13 semanas de edad por vía intranasal, bajo anestesia, con una dosis letal (10 000 UFP titulada en VeroE6-TMPRESS2-T2A- células ACE2) del SARS-CoV-2 ancestral USA_WA-1/2020 (WA-1). A partir del día de la infección, alojamos conjuntamente a los ratones índice infectados con contactos ingenuos en una proporción de 1 índice a 2-3 contactos (Fig. 1a complementaria). Supervisamos la morbilidad (pérdida de peso) y la mortalidad (punto final humano) y recolectamos muestras longitudinales de desprendimiento nasal de forma no invasiva y sin anestesia, sumergiendo las fosas nasales en medios virales. Por lo tanto, pudimos aprovechar la cinética del desprendimiento del tracto respiratorio superior (URT) en ratones individuales, longitudinalmente, como una medida de infección viral. A diferencia de los ratones índice, no observamos morbilidad ni mortalidad en los ratones de contacto al final del experimento (10 días después de la infección índice) (Figuras complementarias 1b, c). Los ratones índice arrojan partículas infecciosas a partir del día 1 al 6 después de la infección, con un pico de liberación viral en el día 2 (Fig. 1d complementaria). Detectamos virus infecciosos en muestras de eliminación de URT en cualquier momento en solo 1/9 (11% en total) de los animales de contacto (Fig. 1d complementaria). Este era el mismo animal de contacto que todavía tenía títulos infecciosos en la URT y el pulmón a 10 ppp (Fig. 1e complementaria). Por jaula, esto representó 0/3 (0%), 0/3 (0%) o 1/3 (33%) de eficiencia de transmisión. En un experimento paralelo, determinamos la transmisión por seroconversión por contacto (Fig. 1f complementaria). Los ratones infectados con PBS sirvieron como control negativo y los ratones infectados con una dosis subletal (1000 PFU) como control positivo para la seroconversión. En el punto final experimental de 22 días después de la infección índice, encontramos que 1/5 (20%) de los ratones de contacto se habían seroconvertido (Fig. 1f complementaria). Por jaula, esto representó 0/3 (0%) o 1/2 (50%) de transmisión. Concluimos que la transmisión por contacto de WA-1 en ratones adultos K18-hACE2 ocurre, aunque con baja eficiencia y con alta variabilidad de jaula a jaula. Por lo tanto, al igual que el modelo de transmisión del virus de la influenza, a continuación nos propusimos establecer la infección por SARS-CoV-2 en ratones recién nacidos.

Primero realizamos un experimento de dosis-respuesta para determinar la dosis viral mínima requerida para producir una infección sólida por SARS-CoV-2 y excreción en los recién nacidos. Combinamos machos C57BL/6 K18-hACE2+/+ y hembras C57BL/6 (hACE2-/-) para producir descendencia K18-hACE2+/- permisiva al SARS-CoV-2 WA-1. A los 4-7 días de edad, las crías se infectaron por vía intranasal con 3 µL de ancestral WA-1 sin anestesia. Usamos una dosis viral creciente de 1500, 15 000 o 50 000 PFU. Luego monitoreamos la morbilidad (falta de aumento de peso) y la mortalidad (punto final humano) y recolectamos muestras de desprendimiento nasal longitudinal diaria sumergiendo las fosas nasales en medios de recolección (Fig. 1g complementaria). Los cachorros infectados con 1500 PFU no lograron aumentar de peso el día 3 después de la infección (3 ppp), y todos sucumbieron a la infección a los 4 ppp. Los cachorros infectados con 15 000 o 50 000 UFP murieron a los 3 ppp antes de que se produjera una pérdida de peso detectable (Figura complementaria 1h, i). Los títulos de eliminación nasal entre cachorros infectados con 1500, 15 000 o 50 000 PFU fueron similares en 1 y 2 dpi, pero se hicieron evidentes en 3 dpi (Fig. 1j complementaria): los títulos de cachorros infectados con 1500 PFU disminuyeron en comparación con 2 dpi, mientras que los títulos de cachorros infectados con 15 000 PFU permanecieron al mismo nivel que 2 dpi, y los títulos de cachorros infectados con 50 000 PFU aumentaron más allá de lo detectado a 2 dpi. La diferencia de título de desprendimiento detectada entre los grupos de 1500 y 50 000 UFP a 3 ppp fue de aproximadamente 100 veces. Esto muestra que un título de entrada en aumento puede modular la dinámica de la eliminación viral en nuestro modelo. Como la dosis más baja probada de 1500 PFU produjo una infección robusta y dejó un día adicional para que se produjera la transmisión antes de que los ratones índice sucumbieran a la infección, utilizamos 1500 PFU como inóculo estandarizado en los experimentos posteriores de infección neonatal en ratones.

A continuación, probamos la transmisión dentro de la camada de WA-1 en ratones recién nacidos. Infectamos ratones índice K18-hACE2+/- de 4 a 7 días de edad con 1500 UFP de WA-1 y los colocamos de nuevo con la madre (no permisiva) y sus compañeros de camada ingenuos (permisivos) en una proporción de 1 índice por 4-6 contactos. ratones (Fig. 1a). Primero observamos que tanto la morbilidad como la mortalidad se compensaron en ratones de contacto en 2-3 días en comparación con los ratones índice (Fig. 1b, c), lo que indica una transmisión exitosa. En los ratones índice, detectamos el ARN del SARS-CoV-2 tan pronto como 1 ppp, con un máximo de 2 ppp, mientras que algunos cachorros de contacto comenzaron a eliminar el ARN viral a partir de los 2 ppp, con un pico de 4 ppp (Fig. 1d). Un experimento paralelo con SARS-CoV-2 inactivado por calor mostró que los genomas virales en las muestras de desprendimiento se debieron a la replicación viral activa y no al arrastre de los inóculos (Fig. 1k complementaria). La detección del ARN del SARS-CoV-2 en ratones de contacto fue, por lo tanto, otra indicación de transmisión. Sin embargo, definimos estrictamente la transmisión como la detección sostenida de partículas virales infecciosas en ratones en contacto. Por lo tanto, determinamos los títulos virales en muestras de desprendimiento nasal mediante ensayo de placa. Las partículas infecciosas de los ratones índice (Fig. 1e) se correlacionaron con el inicio y la disminución de la detección de ARN (Fig. 1d). La detección de partículas infecciosas en cachorros de contacto confirmó la transmisión del SARS-CoV-2. Las partículas infecciosas en los contactos alcanzaron su punto máximo el día 4 y disminuyeron los días 5 y 6, de manera similar a las tendencias del ARN del SARS-CoV-2. Es de destacar que todos los cachorros de contacto arrojan partículas infecciosas el día 4, lo que representa 16/16 (100%) de transmisión de WA-1 en nuestro modelo.

a Cachorros K18-hACE2+/- de cuatro a siete días de edad se infectaron por vía intranasal con 1500 PFU de SARS-CoV-2 WA-1 y se alojaron juntos con compañeros de camada no infectados durante 6 días. El peso y la supervivencia se monitorearon diariamente, y las muestras de excreción viral se recolectaron sumergiendo las fosas nasales de cada cachorro individual en medio viral diariamente. Datos de dos repeticiones independientes, con un total de n = 4 índice y n = 9 ratones de contacto. Peso corporal medio (b) y supervivencia (c) de las crías índice y de contacto. Carga viral en muestras de excreción analizadas por RT-qPCR para ARN de SARS-CoV-2 (d) y por ensayo de placa para virus infeccioso (e). Datos mostrados como media geométrica (línea) con desviación estándar geométrica (área sombreada). Los valores individuales por debajo del límite de detección (50 UFP/ml) se establecieron en 5. f Inmunohistoquímica para la proteína N del SARS-CoV-2 en nasofaringe de ratones de 4 a 7 días de edad. Los cachorros se infectaron por vía intranasal con 1500 UFP de SARS-CoV-2 WA-1, y las cabezas se fijaron a 2 ppp, se incluyeron en parafina, se seccionaron a través de la nasofaringe y se tiñeron para la proteína N del SARS-CoV-2 (amarillo) y DAPI (azul). ) para núcleos. Las flechas representan áreas ampliadas en los paneles adyacentes. OE y RE indican epitelio olfatorio y epitelio respiratorio, respectivamente. Creado con BioRender.com.

La detección de partículas infecciosas en muestras de desprendimiento de ratones neonatales K18-hACE2 sugirió una infección viral robusta en la URT. Para determinar los sitios de infección dentro de la URT en granularidad espacial, realizamos inmunohistoquímica (IHC) en la nasofaringe de los cachorros índice. Las cabezas de los ratones recién nacidos se recolectaron en su punto máximo de excreción viral (2 ppp), se seccionaron a través de la nasofaringe y se tiñeron para la proteína N del SARS-CoV-2. Detectamos células positivas para SARS-CoV-2 en el revestimiento del epitelio respiratorio y olfativo superior, lo que demuestra la replicación de SARS-CoV-2 WA-1 en las células de la URT (Fig. 1f). En conjunto, estos resultados establecen y validan un modelo de ratón K18-hACE2 neonatal manejable para la transmisión del SARS-CoV-2.

Se ha propuesto que la alta transmisibilidad de las variantes alfa y delta del SARS-CoV-2 sea impulsada por la replicación y el desprendimiento eficientes de URT30,31. Esto contrasta con la literatura sobre el virus de la influenza, donde la replicación de URT no está correlacionada con la generación o transmisión de aerosoles en humanos32. Usando el modelo de ratón recién nacido, recapitulamos experimentalmente que la eficiencia de transmisión del virus de la influenza no se correlaciona con los títulos de URT, sino con la cantidad de virus exhalado en las secreciones derramadas17. Otros han demostrado que la transmisión del virus de la influenza depende tanto del momento como de la magnitud del pico de excreción33,34. Se observaron observaciones similares para el SARS CoV-2 en hámsters sirios, donde los títulos de virus orales de los hisopos eran un mal indicador de la diseminación en el aire, pero el pico de virus en el aire se correlacionó con la transmisión35.

Para identificar los índices correlativos de la transmisión del SARS-CoV-2 en nuestro modelo, caracterizamos las cargas virales en varios compartimentos respiratorios: tracto respiratorio inferior (homogeneizados de pulmón), URT (lavados traqueales retro) o secreciones eliminadas (virus expulsado). Comenzamos evaluando la dinámica de la replicación viral dentro de estos compartimentos para el virus ancestral WA-1. Se infectaron cachorros K18-hACE2+/- de 4 a 7 días de edad con 1500 UFP de WA-1 y se midió la carga de partículas infecciosas en el tipo de muestra respectivo a 1, 2 y 3 ppp (Fig. 2a, b, Fig. 2a complementaria) . A 1 dpi, los títulos expulsados ​​y URT fueron más altos que los títulos pulmonares, aunque no estadísticamente significativos. A los 2 ppp, los títulos expulsados, URT y pulmonares eran similares entre sí. A los 3 ppp, los títulos de eliminación disminuyeron, mientras que los títulos pulmonares aumentaron, dando como resultado títulos pulmonares que fueron significativamente más altos que los títulos de eliminación. Esto sugiere que en nuestro modelo, la infección por SARS-CoV-2 WA-1 administrada en un volumen bajo por vía intranasal sin anestesia progresa desde la URT hasta los pulmones con el tiempo.

Se infectaron ratones K18-hACE2+/- neonatales con el SARS-CoV-2 indicado y se recogieron diariamente muestras de excreción viral. A los 2 dpi, se recolectaron lavados retrotraqueales y pulmones para determinar los títulos virales y las cabezas se fijaron para inmunohistoquímica. b–g Carga viral en muestras de excreción diaria (izquierda) y a 2 ppp en muestras de excreción, tracto respiratorio superior y pulmones (derecha). Los valores individuales por debajo del límite de detección (LOD, 50 UFP/ml) se fijaron en 5. Datos de al menos 2 repeticiones independientes con n = 6 - 15 cachorros por grupo. Solo se presentan valores de p significativos (prueba de Kruskal-Wallis). h Inmunohistoquímica para SARS-CoV-2 N a 2 dpi en nasofaringe. Creado con BioRender.com.

A continuación, comparamos la dinámica de eliminación de URT de virus ancestrales y variantes. Primero generamos stocks de trabajo virales clonales (purificados en placa), purificados en sacarosa y secuenciados en profundidad. Este proceso riguroso de control de calidad garantiza la identidad de los VOC (es decir, la presencia de mutaciones que definen variantes) y su integridad (la falta de mutaciones inducidas por cultivo de tejidos). Luego infectamos cachorros K18-hACE2+/- con 1500 PFU de Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2), Omicron BA .1 u Omicron BQ.1.1. Primero determinamos la dinámica de la eliminación del virus infeccioso para cada aislamiento de 1 a 4 ppp o hasta que los cachorros sucumbieron a la infección (Fig. 2a, Fig. 3 complementaria). El desprendimiento de ratones infectados con WA-1 ancestral alcanzó su punto máximo a los 2 ppp antes de disminuir en 3 ppp (Fig. 2b). En contraste con WA-1, el desprendimiento de ratones infectados con Alpha alcanzó su punto máximo antes, a 1 dpi, y disminuyó abruptamente a 2 dpi (Fig. 2c). El desprendimiento de ratones infectados con Beta también alcanzó un máximo de 1, pero, a diferencia de Alpha, permaneció en el mismo nivel en 2 dpi antes de disminuir en 3 dpi, lo que resultó en un título similar al de las crías infectadas con WA-1 (Fig. 2d). El desprendimiento de ratones infectados con Gamma y Delta tuvo una pendiente similar a WA-1, con un pico a 2 ppp, antes de disminuir en 3 ppp (Fig. 2e, f). Los títulos de eliminación de los cachorros infectados con Gamma fueron, en promedio, más bajos que los de los cachorros infectados con WA-1, aunque no estadísticamente significativos (Fig. 2e). Los ratones infectados con aislamientos de Omicron BA.1 o BQ1.1 arrojan niveles bajos de virus en general, con la mayoría de las réplicas por debajo del límite de detección (Fig. 2g, Fig. 2d complementaria). Sin embargo, estas dos variantes de Omicron difieren con respecto a la cinética de desprendimiento: el desprendimiento de BQ.1.1 alcanzó su punto máximo a 1 ppp frente a BA.1 a 3 ppp (Fig. 2g, Fig. 2d complementaria). Por lo tanto, nuestro modelo puede capturar la cinética única de la variante URT del SARS-CoV-2 que se desprende de los cachorros infectados.

Luego comparamos los sitios de replicación viral para cada variante y encontramos que la distribución de la carga viral en diferentes tipos de muestras era distinta para virus específicos. Para Alpha, los títulos de desprendimiento y URT a 2 dpi fueron comparables en magnitud a 2 dpi WA-1 (Fig. 2b, c), pero los títulos pulmonares tenían una tendencia más baja (Fig. 2c). Para determinar si estos títulos pulmonares más bajos fueron una consecuencia del inicio más temprano y la disminución de la replicación y el desprendimiento de Alpha, analizamos las cargas virales de Alpha en los tres compartimentos también en el día pico de desprendimiento de Alpha, 1 ppp (Suplemento Fig. 2b, panel izquierdo). Nuevamente, encontramos títulos significativamente más altos en las muestras de desprendimiento y URT que en los pulmones, lo que sugiere que, en nuestro modelo, tanto en 1 como en 2 ppp, Alpha se replica mejor en la URT. Para Beta, Gamma y Delta no encontramos diferencias significativas en los títulos entre el virus eliminado, la URT y los pulmones, lo que sugiere la misma capacidad para infectar y replicarse tanto en la URT como en el tracto respiratorio inferior y para eliminarse de la URT (Fig. 2d -F). De hecho, IHC de la región URT confirmó que WA-1, Alpha, Beta, Gamma y Delta infectan la URT de manera eficiente (Fig. 2h). Por el contrario, los títulos de BQ1.1 en URT y pulmones a 2 ppp fueron indetectables (Fig. 2g), y la IHC no reveló células infectadas con Omicron BQ.1.1 en el epitelio URT (Fig. 2h). Para determinar si estos títulos indetectables fueron una consecuencia del inicio más temprano y la disminución de la replicación y eliminación de BQ1.1, analizamos las cargas virales de Omicron BQ.1.1 en los tres compartimentos también en su día pico de eliminación, 1 ppp. Descubrimos que los títulos promedio aún eran bajos en los tres compartimentos, y que algunas muestras estaban por encima del límite de detección en muestras de desprendimiento y URT (Figura 2c complementaria). Estos resultados fueron similares a los datos de 1 ppp obtenidos para Omicron BA.1 (Figuras complementarias 2e, f). No se detectaron partículas infecciosas de Omicron en los pulmones para ninguna de las subvariantes de Omicron, lo que sugiere que Omicron no se replica de manera eficiente en ratones neonatales K18-hACE2 (Fig. 2g, Fig. 2e complementaria). Nuestros resultados están en línea con los hallazgos de otros, mostrando que las variantes de Omicron están atenuadas en hámsteres y ratones, a pesar de la presencia de su receptor hACE2 en el modelo K1824,36,37.

Curiosamente, las cargas virales en las muestras eliminadas fueron similares a las de sus respectivas muestras de lavado retrotraqueal para todos los aislamientos virales, lo que demuestra que, en nuestro modelo, los virus SARS-CoV-2 analizados no muestran un defecto en la expulsión viral y, por lo tanto, URT el desprendimiento se puede utilizar como proxy para la replicación URT del SARS-CoV-2.

En conjunto, nuestros resultados demuestran que, a excepción de las variantes de Omicron, nuestro modelo permite una replicación y eliminación eficientes de las variantes del SARS-CoV-2 en niveles comparables al ancestral WA-1. La cinética de eliminación temporal difiere entre las variantes y permite que este modelo se use como una herramienta para comprender los mecanismos de transmisión de la variante SARS-CoV-2.

A continuación, utilizamos nuestro panel de variantes de SARS-CoV-2 que van desde aislamientos pandémicos tempranos hasta actuales para probar la transmisión. Los ratones índice K18-hACE2+/- de 4 a 7 días de edad se infectaron con SARS-CoV-2 WA-1, Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron BA.1 u Omicron BQ.1.1 ancestrales y se alojaron conjuntamente con recién nacidos. ratones en una proporción de 1:6-9. Los ratones índice infectados con WA-1, alfa, beta y delta sucumbieron a la infección a los 3 ppp (suplementario Fig. 3a-c, e). Los ratones índice infectados con rayos gamma sucumbieron a los 4 ppp (Fig. 3d complementaria). Para los ratones índice infectados con Delta y Omicron BA.1, la morbilidad (falta de aumento de peso) y la mortalidad se retrasaron, y para los ratones índice infectados con Omicron BQ.1.1, no detectamos una morbilidad sustancial pero sí una mortalidad completa, aunque retrasada, de ratones índice (Fig. 3e-g suplementaria). Los eventos de transmisión que ocurren en puntos de tiempo tardíos, después de la muerte de las crías índice, pueden provenir del inicio tardío de la eliminación de contactos o de la transmisión secuencial entre contactos. Excepto por las dos variantes de Omicron, algunos o todos los ratones en contacto en jaulas con otras variantes sucumbieron a la infección a los 7 ppp (Fig. 3 complementaria).

Luego investigamos la dinámica de transmisión utilizando dos lecturas no redundantes de cachorros de contacto: 1. Momento de la adquisición viral por contactos: Cuantificamos la adquisición de virus por cachorros de contacto como "eventos de transmisión" cuando el virus se detecta al menos dos veces en muestras de desprendimiento (Fig. . 3). El primer día de diseminación viral de cada contacto ("virus infeccioso positivo") se cuenta como el inicio de la adquisición. Esto nos permite evaluar la adquisición viral en función del tiempo y comparar la cinética de adquisición entre variantes. Sin embargo, esta lectura no representa la amplitud de la infección por contacto. 2. Detección de títulos virales de excreción de URT de animales de contacto: esta medida permite la detección de variaciones sutiles en el nivel de excreción de contacto. Las diferencias en la amplitud de eliminación observadas en nuestros experimentos pueden deberse a las variaciones en la eliminación por parte de los ratones índice (es decir, la dosis infecciosa y el tiempo de transmisión por el índice) y/o las diferencias en la aptitud replicativa viral en los contactos. Los cambios en los títulos de desprendimiento de contacto pueden ser importantes en los experimentos de transmisión secuencial, donde los contactos se convierten en índice para individuos ingenuos. Para WA-1 y Alpha, se alcanzó el 100 % de transmisión a 3 o 4 dpi, respectivamente, con pendientes que no fueron significativamente diferentes (Fig. 3a, panel izquierdo). Tanto las partículas infecciosas ancestrales WA-1 como Alpha se detectaron en algunos ratones de contacto tan pronto como 1 dpi, y las de Alpha fueron significativamente más altas que las de WA-1 en 3 dpi, lo que sugiere una ligera ventaja de transmisión por parte de Alpha. Los títulos de desprendimiento de contacto alfa alcanzaron su punto máximo a los 4 ppp y se desvanecieron antes que WA-1, comenzando a los 4 ppp (Fig. 3a, panel derecho), lo que está en línea con la caída temprana de los títulos de desprendimiento observados previamente en ratones índice alfa (Fig. 2c). En contraste con Alpha, los ratones de contacto Beta mostraron una adquisición significativamente retrasada en comparación con WA-1 (Fig. 3b, panel izquierdo), pero alcanzaron títulos de contacto máximos similares (Fig. 3b, panel derecho). Los ratones de contacto gamma mostraron una adquisición significativamente retrasada en comparación con WA-1 (Fig. 3c, panel izquierdo) y lograron una transmisión general del 73%. Los ratones de contacto gamma también tenían una carga viral más baja en general, aunque la cinética hacia y desde el título máximo fue similar a la de WA-1 (Fig. 3c, panel derecho). Al igual que Gamma, los ratones de contacto Delta se retrasaron significativamente con los ratones de contacto WA-1 con respecto a la adquisición (Fig. 3d, panel izquierdo), y los niveles máximos de virus infecciosos de los contactos Delta fueron similares a WA-1 (Fig. 3d, panel derecho). Los contactos infectados con Delta continuaron arrojando partículas infecciosas hasta el final del experimento a 7 ppp (Fig. 3d, panel derecho). Los ratones de contacto con Omicron BA.1 no adquirieron infección en nuestro modelo ni excretaron virus infecciosos (Fig. 3e), lo cual está en línea con otros informes que muestran que Omicron BA.1 se atenúa y la transmisión aérea se reduce en roedores24,36,37 ,38. Curiosamente, y en contraste con BA.1, los ratones de contacto Omicron BQ.1.1 lograron una transmisión del 25% en nuestro modelo (Fig. 3f, panel izquierdo). BQ.1.1. desprendimiento índice con títulos virales excepcionalmente bajos (Fig. 2g) que se correspondía con una tasa de transmisión más baja y un desprendimiento de contacto bajo (Fig. 3f, panel derecho). La diferencia de transmisión entre BA.1 y BQ.1.1 fue sorprendente dado que los títulos máximos de eliminación de ambas subvariantes de Omicron en los animales índice fueron igualmente bajos (Fig. 2g, Fig. 2c complementaria). Es posible que el momento del desprendimiento máximo (1 ppp para BQ.1.1 frente a 3 ppp para BA.1) sea el determinante crítico para la transmisión de Omicron en nuestro modelo. En general, nuestros datos muestran que la magnitud del desprendimiento del índice se corresponde con el éxito de la transmisión a los contactos (Fig. 2g complementaria).

Se infectaron ratones K18-hACE2+/- neonatales con el SARS-CoV-2 indicado y se alojaron juntos con compañeros de camada no infectados durante 7 días en una proporción de 1:6-9. Se controló diariamente la adquisición de la infección y la carga viral en ratones de contacto. Ancestral WA-1 se comparó con las variantes Alpha (a), Beta (b), Gamma (c), Delta (d), Omicron BA.1 (e) y Omicron BQ1.1 (f). Los paneles de la izquierda muestran el porcentaje de adquisición viral en diagramas invertidos de Kaplan-Meier. El inicio de la adquisición se calificó como el primer día de detección sostenida del virus infeccioso. Los paneles de la derecha muestran la carga viral en muestras de desprendimiento de contacto determinada por ensayo de placa. Los datos se muestran como media geométrica (línea) con desviación estándar geométrica (área sombreada). Los valores individuales por debajo del límite de detección (50 UFP/ml) se fijaron en 5. Datos de al menos 2 repeticiones independientes n = 1 índice y 4-6 crías de contacto por repetición. Solo se presentan valores de p significativos (prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox para diagramas de Kaplan-Meier, prueba de Kruskal-Wallis para carga viral).

A continuación, caracterizamos el repertorio inflamatorio URT de ratones índice después del desafío viral en nuestro modelo. Se espera que una respuesta antiviral/inflamatoria a la infección atenúe el virus dentro del huésped, causando una transmisión reducida5,39. Sin embargo, el aumento de la inflamación también puede inducir secreciones de URT que ayudan a expulsar el virus al medio ambiente, lo que puede favorecer la transmisión20,22. Analizamos las citocinas presentes en muestras de excreción de URT de ratones índice mediante ELISA multiplex a las 6, 24 y 48 h, utilizando SARS-CoV-2 WA-1 inactivado por calor (HI) o poli (I: C) como controles. Detectamos la presencia de múltiples citocinas en ratones tratados con poli (I: C) en el punto de tiempo de 48 h, aunque a niveles más bajos que en los ratones infectados con WA-1 (Fig. 4a complementaria). HI WA-1 no logró inducir una inflamación medible en los puntos de tiempo, mientras que detectamos un aumento de los niveles de citoquinas en muestras de ratones infectados con WA-1 a las 48 h (Fig. 4a complementaria). Esto sugiere que nuestras reservas virales purificadas no contienen material inflamatorio exógeno, que se requiere la replicación activa de WA-1 para impulsar la inflamación en nuestro modelo y que el punto de tiempo de 48 h es óptimo para medir el perfil de citoquinas en muestras de desprendimiento de URT.

Para explorar una asociación potencial entre la inflamación y la transmisión de URT índice, medimos las citocinas en muestras de excreción de ratones índice infectados con SARS-CoV-2 WA-1 ancestral o variantes Alfa, Beta, Gamma, Delta, Omicron BA.1 y Omicron BQ .1.1 a 48 hpi. Los títulos de eliminación de virus infecciosos comparables en este momento para la mayoría de las variantes, entre 104 y 105 PFU/mL (Fig. 2), permitieron la comparación cualitativa de las firmas de citocinas entre estos virus que se replican por igual. Ambas variantes de Omicron tenían títulos de excreción viral mucho más bajos a las 48 hpi (101 UFP/mL, Fig. 2g) y, en consecuencia, las firmas de citoquinas para ambas variantes de Omicron a las 48 hpi estaban tranquilas (Fig. 4b complementaria). En particular, a las 24 hpi, que es el momento máximo de eliminación de BQ.1.1, detectamos un aumento de los niveles de citoquinas en el índice de infección por BQ.1.1 (Fig. 2g, Datos extendidos 4c), pero no encontramos tal aumento en BA.1- ratones infectados, donde el desprendimiento alcanza su punto máximo más tarde, a las 72 hpi (Fig. 2d suplementaria, Fig. 4c suplementaria). Para virus igualmente replicantes (WA-1, Alfa, Beta, Gamma y Delta) encontramos que la firma de citoquinas en la infección ancestral con WA-1 era la más diferente de las firmas en la infección con variantes (Fig. 4b complementaria). Las firmas Gamma y Alpha se agruparon, al igual que las firmas Alpha y Delta, respectivamente. El conjunto de citoquinas reguladas al alza clave fue similar entre virus que se replican por igual (Fig. 4b complementaria, cuadrante superior izquierdo), pero la amplitud de la regulación al alza difirió entre los virus. En particular, la distancia del grupo de citocinas de los diferentes virus se correlacionó con su respectiva eficiencia de transmisión (Fig. 4d complementaria), excepto Alpha. Se necesitan más estudios para descifrar si hay alguna y, en caso afirmativo, qué citoquinas URT específicas inducidas por los cachorros índice contribuyen a la transmisión (Fig. 4b y Fig. 3 complementarias). Nuestro modelo y la disponibilidad de ratones transgénicos con interrupciones en las principales vías de citoquinas nos permite realizar estos estudios futuros de manera única.

En conjunto, nuestros resultados muestran que nuestro modelo de ratón neonatal puede caracterizar las diferencias en la dinámica de transmisión inherente a las variantes del SARS-CoV-2. Nuestro método diario de muestreo viral permite rastrear la replicación viral en índices individuales y ratones de contacto a lo largo del tiempo, proporcionando granularidad en los parámetros de transmisión, incluida la asociación de firmas de citoquinas específicas de variante y transmisión.

Además de las mutaciones en pico, varias variantes de SARS-CoV-2 muestran mutaciones en genes accesorios, como ORF3, ORF6, ORF7 y ORF8, que se han implicado en la interferencia de la señalización inmunitaria o la contrarrestación directa del efector del huésped6,8,10 ,40,41,42,43,44. La ventaja selectiva de los cambios en estas proteínas accesorias, si las hay, sigue sin definirse, particularmente en lo que respecta a la transmisión. Por lo tanto, nuestro objetivo era determinar cómo la falta de proteínas accesorias específicas afecta la transmisión del SARS-CoV-2 en nuestro modelo y nos centramos en dos proteínas accesorias: ORF8, porque tiene mutaciones que definen las variantes alfa, gamma y delta, y ORF6, que carece de mutaciones en las variantes utilizadas en este estudio pero está mutado en algunas variantes de Omicron (es decir, BA.2, BA.4), además de ser una de las proteínas accesorias del SARS-CoV-2 mejor caracterizadas1,42,43, 44. Ambos virus recombinantes se han caracterizado en células cultivadas y en ratones adultos K18-hACE245, revelando títulos virales reducidos in vitro, pero títulos pulmonares similares in vivo. Curiosamente, el virus que carece de ORF8 mostró una mayor puntuación de patología pulmonar45, lo que puede sugerir que este virus induce un mayor proceso inflamatorio.

Infectamos ratones neonatales K18-hACE2+/- con 1500 UFP de SARS-CoV-2 WA-1 recombinante (rWA-1), SARS-CoV-2 recombinante sin ORF6 (ΔORF6) o SARS-CoV-2 recombinante sin ORF8 ( ΔORF8). De manera similar a nuestras observaciones anteriores con el aislado clínico WA-1 (Fig. 2b), los títulos de eliminación de los ratones índice rWA-1 alcanzaron un máximo de 2 dpi y disminuyeron 3 dpi (Fig. 4a, panel izquierdo). La eliminación del índice de ratones infectados con ΔORF6 fue similar a la cinética de rWA-1, con una tendencia de menor magnitud (5 veces a 2 ppp, Fig. 4b, panel izquierdo). Los ratones índice infectados con ΔORF8 expulsaron constantemente hasta 100 veces menos virus que los ratones infectados con rWA-1 (Fig. 4c, panel izquierdo) y sobrevivieron 1 día más que el índice infectado con rWA-1 (Fig. 5a-c complementaria), por lo tanto todavía arrojando a 4 ppp. A continuación, analizamos la replicación del virus en muestras eliminadas (virus expulsado), lavados URT (replicación URT) y pulmones (replicación del tracto respiratorio inferior) de ratones índice. Al igual que el aislado WA-1, observamos títulos de rWA-1 mucho más altos en los pulmones que en las muestras de URT y excreción (Fig. 4a, panel derecho). Para ΔORF6, obtuvimos títulos similares en los tres tipos de muestras, 1 × 104 PFU/mL en promedio, aunque hubo una amplia distribución con algunos cachorros que mostraron títulos virales más altos en el pulmón que en las muestras de excreción o URT (Fig. 4b, derecha). panel). Concluimos que, en nuestro modelo, la falta de ORF6 no atenuó significativamente la replicación viral, el desprendimiento ni cambió significativamente el tropismo tisular con respecto al rWA-1 parental. Esto fue diferente para ORF8. El desprendimiento de ΔORF8 y los títulos de URT fueron más bajos que para rWA-1 o ΔORF6 (Fig. 4c, panel izquierdo). Sorprendentemente, la carga viral en los pulmones fue comparable a la de rWA-1 y WA-1 ΔORF6. Esto fue similar a hallazgos previos en ratones adultos, donde la falta de ORF8 no alteró los títulos pulmonares41,45. Por lo tanto, la falta de ORF8 parece reducir significativamente la capacidad de ΔORF8 para replicarse sólidamente específicamente en la URT.

Se infectaron ratones K18-hACE2+/- neonatales por vía intranasal con 1500 UFP de WA-1 recombinante (rWA-1), rWA-1 sin ORF6 (ΔORF6) o rWA-1 sin ORF8 (ΔORF8). ac Carga viral en muestras de excreción diaria (izquierda) y en muestras de excreción de 2 dpi, tracto respiratorio superior (URT) y pulmones (derecha). Datos de al menos n = 5 cachorros por grupo. df Porcentaje de adquisición viral mostrado en diagramas de Kaplan-Meier invertidos y carga viral infecciosa en muestras de desprendimiento de contacto, mostrado como media geométrica (línea) con desviación estándar geométrica (área sombreada). Datos de al menos 2 repeticiones independientes con n = 1 índice y 4-6 contactos cada una. af Solo se presentan valores de p significativos (prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox para diagramas de Kaplan-Meier, prueba de Kruskal-Wallis para carga viral). Los valores individuales por debajo del límite de detección (LOD, 50 PFU/ml) se establecieron en 5. g Mapa de calor que representa los niveles de citoquinas a 2 dpi en lavados retrotraqueales y pulmones medidos por ELISA multiplex. Los datos representan una inducción de veces sobre cachorros inoculados con PBS. Al menos n = 3 cachorros por condición. h Inmunohistoquímica para SARS-CoV-2 N a 2 dpi en nasofaringe.

Luego realizamos experimentos de transmisión con los tres virus recombinantes. Al igual que el aislado WA-1, la adquisición de rWA-1 por parte de los contactos se produjo a 1 ppp, se completó a los 4 ppp y los títulos de desprendimiento de contacto disminuyeron a partir de los 4 ppp (Fig. 4d). ΔORF6 fue similar al rWA-1 parental tanto en el inicio, la dinámica y la adquisición del desprendimiento de contacto (Fig. 4e). Juntos, estos resultados sugieren que la falta de ORF6 no atenúa significativamente la transmisión en nuestro modelo. El inicio de la adquisición para ΔORF8 fue similar a rWA-1 y ΔORF6, 1 ppp, pero a diferencia de los otros dos virus recombinantes, la pendiente de adquisición fue más lenta y la transmisión fue del 76 % (Fig. 4f). Presumimos que esta reducción en la eficiencia de la transmisión es una consecuencia de los títulos de eliminación más bajos de los ratones índice.

A continuación, analizamos los niveles de citoquinas en URT y muestras de pulmón de ratones índice mediante ELISA multiplex (Fig. 4g). Descubrimos que los niveles de citoquinas presentes en la URT de ratones infectados con ΔORF8 tenían una magnitud similar a los infectados con rWA-1 y ΔORF6, a pesar de que los títulos de WA-1 ΔORF8 eran 100 veces más bajos en el mismo punto de tiempo (2 ppp). Esto sugiere un aumento de la firma inflamatoria de ΔORF8 en relación con la cantidad de virus presente en la URT. En los pulmones, que muestran títulos virales similares en los tres virus (Fig. 4g), observamos un patrón similar de citocinas entre los ratones infectados con ΔORF8 y rWA-1 (Fig. 4g). Cómo y si la inflamación por ΔORF8 atenúa la replicación viral específicamente en la URT, pero no en los pulmones, sigue siendo un tema de investigación adicional. Cabe señalar que los niveles de citoquinas estaban elevados en los pulmones infectados con ΔORF6 en comparación con los pulmones infectados con rWA-1 y ΔORF8, en particular con IL-6, lo que sugiere que el virus recombinante que carece de ORF6 no puede suprimir la producción de ciertas citoquinas en los pulmones de los recién nacidos. ratones.

En conjunto, nuestros resultados muestran cómo la eliminación de una proteína accesoria del SARS-CoV-2, ORF8, reduce la replicación de URT, lo que da como resultado una reducción de la eliminación y la transmisión en ratones recién nacidos. Nuestro modelo de ratón neonatal permite una visión única de estos procesos moleculares en granularidad espacial, y la disponibilidad de reactivos específicos de ratón permitirá futuros estudios mecánicos sobre el papel de ORF8 en la replicación y transmisión de URT.

Los modelos de ratón de infección por SARS-CoV-2 se han utilizado ampliamente para estudiar la patogénesis de las variantes emergentes de SARS-CoV-246,47,48,49,50,51,52. Sin embargo, los ratones adultos no transmiten de manera sólida el SARS-CoV-2 (Fig. 1a-f complementaria y ref. 27). En nuestro estudio, desarrollamos y validamos un modelo de ratón neonatal para caracterizar la transmisión de aislamientos humanos de SARS-CoV-2 en base a nuestra experiencia previa con el virus de la influenza A (Fig. 1 y ref. 17). Usando un panel único de SARS-CoV-2 que abarca aislamientos humanos pandémicos tempranos a actuales, demostramos cómo las mutaciones inherentes a las variantes afectan el tropismo y el desprendimiento (Fig. 2), la transmisión (Fig. 3) y los repertorios de citoquinas del tracto respiratorio superior (Fig. Suplementario . 4). Finalmente, nuestro estudio revela un papel previamente no apreciado para la proteína accesoria ORF8 en la replicación, inflamación y transmisión del tracto respiratorio superior viral en ratones recién nacidos (Fig. 4), lo que muestra el poder de nuestro modelo para estudiar los determinantes moleculares virales y del huésped del SARS -Transmisión de CoV-2 en ratones.

Nuestro modelo tiene varias ventajas sobre los modelos animales existentes de transmisión del SARS-CoV-2: en primer lugar, la sensibilidad a una amplia gama de animales knockout disponibles permite futuros estudios sistemáticos que determinen los factores del huésped que son críticos para la transmisión. En segundo lugar, nuestro modelo permite estudios potenciados, ya que es más fácil lograr un alto número de ratones neonatales de contacto que en otros modelos animales. En tercer lugar, hay menos desafíos de manejo para trabajar con ratones en comparación con hámsteres o hurones. Además, la disponibilidad de reactivos y herramientas específicos para ratones aumenta el potencial para estudiar las vías inmunitarias inducidas por virus en el huésped, así como la mecánica respiratoria que podría afectar la transmisión, como el flujo de aire y la capacidad pulmonar. Finalmente, podemos rastrear la progresión del índice y la infección por contacto longitudinalmente, gracias al muestreo no invasivo. Esto proporciona más granularidad e información sobre la cinética de la eliminación viral y la carga viral URT a nivel de individuos, lo que ilumina nuestra comprensión de la eficiencia de transmisión.

Aunque estas características establecen nuestro modelo como una herramienta única y viable para estudiar la transmisión del SARS-CoV-2, otros modelos animales, como hámsteres y hurones, tienen ciertas ventajas sobre las limitaciones de nuestro sistema. Una limitación de nuestro modelo es que los modos de transmisión no pueden probarse experimentalmente, porque los ratones lactantes no pueden separarse unos de otros ni de su madre. Es probable que la transmisión en el modelo, como en los humanos53,54, se produzca a través de una combinación de modos. La transmisión de aerosoles de largo alcance, como puede ocurrir en humanos55, no se puede medir en nuestra configuración experimental actual. No obstante, el modelo presenta situaciones conductuales favorables tanto para la transmisión del virus de la influenza como del SARS-CoV-2, como se muestra tanto en humanos como en sistemas de modelos animales más clásicos: tiempo prolongado de exposición56, proximidad de individuos en espacios cerrados57 y cohabitación con miembros del hogar54, 58,59,60. Además, nuestro método no invasivo de recolección de muestras de cachorros individuales nos permite medir longitudinalmente la dinámica temporal y la amplitud de la diseminación viral, ambos factores críticos en la transmisión del virus respiratorio17,33,34,61,62,63. Otra limitación de nuestro modelo es que la expresión del transgén hACE2 está impulsada por un promotor K18 no nativo, lo que permite la infección de múltiples órganos y da como resultado niveles de expresión tisular distintos de los Ace249,50 murino expresados ​​endógenamente. Aunque la expresión no es fisiológica, elegimos deliberadamente ratones K18-hACE2 para este estudio inicial de la transmisión del SARS-CoV-2 en ratones, ya que nuestro objetivo era investigar y comparar la transmisión de aislados pandémicos tempranos y actuales, algunos de los cuales no pueden involucrar a Ace2 murino. Reconocemos que la extrapolación de los cambios de tropismo en nuestro modelo al tropismo en humanos justifica la precaución, especialmente si estos cambios son provocados únicamente por cambios en la unión variante de la espiga-ACE2, es decir, a través de mutaciones en el sitio de unión del receptor de la espiga. Sin embargo, argumentamos que los cambios de tropismo provocados por diferencias en el procesamiento de picos y/o por diferencias en la interacción huésped-virus pueden interpretarse fácilmente utilizando nuestro modelo, ya que la expresión de proteasa y la inflamación o el antagonismo no están adulterados por el transgén hACE2. En conjunto, nuestro estudio demuestra cómo la selección entre los modelos animales disponibles debe basarse en el alcance y el contexto de la investigación, ya que cada uno de ellos puede proporcionar información valiosa y no redundante sobre la biología del SARS-CoV-2.

En nuestro modelo, a excepción de Omicron BA.1, observamos una transmisión de variantes del SARS-CoV-2 del 33% o superior, y nuestro método fue lo suficientemente granular como para detectar diferencias sutiles entre las variantes. Por ejemplo, identificamos un pico temprano pero estrecho de replicación URT para Alpha, dejando solo una ventana corta para la transmisión. A pesar de esto, los animales de contacto adquieren Alpha a un ritmo similar al WA-1 ancestral, e incluso muestran títulos de contacto significativamente más altos a 3 ppp. De hecho, Alpha fue el único virus con una eficiencia de transmisión similar o mejor que WA-1, mientras que todas las demás variantes mostraron un retraso significativo en la transmisión en comparación con WA-1. Las variantes post-Alfa surgieron después de la inmunidad generalizada de la población provocada por una infección o inmunización previas, y la evasión viral de la neutralización debido a mutaciones en el gen de la espiga de las variantes está bien documentada64,65,66,67,68,69,70. Por lo tanto, especulamos que las diferencias de transmisión entre WA-1 y las variantes Beta a Delta pueden haber sido menos dramáticas bajo la presión inmunitaria adaptativa o incluso revelar una ventaja de transmisión para estas variantes en comparación con el virus ancestral, con el que se combinan actualmente la mayoría de los regímenes de inmunización. Los estudios futuros con este modelo introducirán presiones inmunitarias adaptativas mediante la vacunación de las madres antes del embarazo. La descendencia adquirirá inmunoglobulinas a través del paso transplacentario o de la leche, lo que se ha demostrado que reduce la transmisión en nuestro modelo del virus de la influenza A17.

Podría decirse que la proteína accesoria ORF8 del SARS-CoV-2 es la más enigmática, ya que solo comparte un 20 % de identidad proteica con el SARS-CoV. Para el SARS-CoV-2, ORF8 es una glicoproteína secretada40,71,72 y se han propuesto diversas funciones inmunomoduladoras, como el mimetismo de IL-17A73,74, la interferencia con la vía del interferón tipo I43, el mimetismo de histonas75 y la regulación a la baja de la clase MHC I76,77, aunque queda por dilucidar el espectro completo de funciones y mecanismos de acción de ORF878. En nuestro modelo, la eliminación de ORF8 resultó en una replicación reducida específicamente en la URT. La magnitud de las citoquinas inflamatorias (Fig. 4) que observamos para ΔORF8 en la URT fue similar a la de los virus parentales WA-1 o ΔORF6, a pesar de que había 100 veces menos virus en ese compartimento. Este aumento de la inflamación fue similar a las observaciones previas en ratones adultos K18-hACE41,45. Es factible que, sin ORF8, el SARS-CoV-2 no suprima las respuestas antivirales críticas en la URT. Argumentamos que la replicación reducida de URT y la consiguiente disminución en el desprendimiento es la causa de la transmisión retrasada y reducida de ΔORF8 en ratones. Además, argumentamos que esto no se debe a una atenuación general del SARS-CoV-2 que carece de ORF8, ya que estos virus se replican de manera eficiente en cultivos de tejidos y en los pulmones de ratones K18-hACE2 tanto neonatales como adultos (Fig. 4 y ref. 45). ). Hasta donde sabemos, este es el único informe hasta la fecha de un papel específico de compartimento de una proteína accesoria SARS-CoV-2 en ratones. Aunque los mecanismos subyacentes para el papel específico de URT de ORF8 siguen siendo desconocidos, es posible que los procesos inflamatorios antivirales provocados por la infección por SARS-CoV-2 sean diferentes en URT de aquellos en el tracto respiratorio inferior. Por ejemplo, el medio celular y las diferencias de temperatura entre la URT y la LRT pueden desempeñar un papel en el comportamiento del virus y la respuesta a la infección en estos compartimentos. Además, la mala conservación de ORF8 entre coronavirus relacionados78, la aparición de una deleción de 382 nucleótidos en el ORF8 de aislados de SARS-CoV-2 en pacientes durante febrero de 2020 y la circulación de un aislado de SARS-CoV-2 que contiene una versión truncada de ORF8 de marzo a octubre de 202079 sugiere que ORF8 es un punto crítico para la adaptación y evolución del SARS-CoV-278. Por ejemplo, la variante Alfa, que también caracterizamos en nuestro estudio, lleva un codón de parada en el aminoácido 27 de ORF8, lo que da como resultado la expresión de una proteína ORF8 truncada1. Curiosamente, en nuestro modelo, ΔORF8 y Alpha no se copiaron en términos de replicación de URT, respuestas de citoquinas o transmisión. Es posible que el ORF8 truncado de alfa retenga funciones que son críticas para la replicación de URT. Otra posibilidad es que el ORF8 de alfa esté inactivo, pero que otras proteínas virales, algunas de las cuales son diferentes del fondo WA-1, proporcionen mecanismos de supresión inmune redundantes que compensen la falta de acción de ORF8 en Alpha. Estudios futuros con SARS-CoV-2 recombinante adicional permitirán desenredar las diferentes hipótesis.

¿Cuáles son los determinantes de la transmisión del SARS-CoV-2 en nuestro modelo? Nuestros datos sugieren que el nivel de título de eliminación del índice infeccioso es importante con respecto a la eficiencia de transmisión. Encontramos que los niveles más bajos de pérdida de índice se correlacionan con una eficiencia de transmisión reducida, como lo muestran las dos variantes de Omicron probadas y ΔORF8. Además, observamos que el momento temprano del pico en el desprendimiento del índice (1 ppp frente a 2 o 3 ppp) favorece la eficiencia de la transmisión, como lo demuestra la ligera ventaja de transmisión de Alpha sobre WA-1 y la clara ventaja de transmisión de Omicron BQ.1.1 sobre BA .1. Finalmente, encontramos que los títulos virales de URT se correlacionan con los títulos de eliminación en todos los virus probados en este estudio, lo que sugiere en general que la replicación URT eficiente y de inicio temprano determina la eficiencia de transmisión del SARS-CoV-2 en nuestro modelo. Por el contrario, en nuestro modelo, encontramos que no hubo asociación entre la eliminación de SARS-CoV-2 y los títulos virales en el LRT, lo que sugiere que el virus presente en los pulmones puede ser el principal responsable de causar la enfermedad, en lugar de facilitando su transmisión.

En resumen, establecimos un modelo de transmisión de SARS-CoV-2 utilizando ratones transgénicos K18-hACE2 neonatales que caracteriza el efecto neto de las mutaciones inherentes a la variante en el tropismo y la transmisión viral y descubre la contribución de las proteínas accesorias a la transmisión. El uso de este modelo animal manejable para definir los mecanismos moleculares subyacentes a la transmisión del SARS-CoV-2 podría guiar el desarrollo de terapias antivirales superiores y contribuir a una mayor comprensión no solo del SARS-CoV-2, sino también de los virus respiratorios en general.

Las células Vero E6 se obtuvieron de ATCC (CRL-1586) y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % (Atlanta Biologicals), Pen/Strep al 1 % (Gibco) y 1 % de anfotericina B (Gibco) a 37 °C con 5% de CO2. Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 se obtuvieron de BEI Resources (NR-54970, RRID: CVCL_C7NK) y se cultivaron en DMEM (Corning) que contenía L-glutamina 4 mM, 4500 mg por L de glucosa, piruvato de sodio 1 mM y 1500 mg por L bicarbonato de sodio, suplementado con suero fetal bovino al 10 % y 10 μg por mL de puromicina (Sigma) a 37 °C con 5 % de CO2. Se confirmó que ambas líneas celulares estaban libres de micoplasma a su llegada ya intervalos mensuales.

Los ratones C57BL/6 J y K18-hACE2 C57BL/6 J (cepa 2B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) (Jackson Laboratories, ME) se mantuvieron y criaron en una instalación animal convencional. Para producir ratones K18-hACE2 C57BL/6 J heterocigotos neonatales para los experimentos de transmisión, se cruzaron hembras C57BL/6 J con machos K18-hACE2 C57BL/6 J homocigotos. Las crías se alojaron con su madre durante todos los experimentos. Se utilizaron animales de experimentación de ambos sexos en todos los experimentos y se agruparon para su análisis. Los experimentos con animales se realizaron en las instalaciones de Nivel 3 de Bioseguridad Animal (ABSL3) de la Escuela de Medicina Grossman de la NYU (Nueva York, NY), de acuerdo con su Manual de Bioseguridad y Procedimientos Operativos Estándar. El estudio recibió la aprobación ética del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina Grossman de NYU (IACUC) bajo el protocolo IACUC # IA18-00071 (Dittmann).

Todo el trabajo con aislamientos infecciosos de SARS-CoV-2 y virus recombinantes, incluido el trabajo con animales infectados, se realizó en las instalaciones de nivel 3 de bioseguridad animal (ABSL3) de la Universidad de Maryland (Baltimore, MD) y la Escuela de Medicina Grossman de la NYU (Nueva York). York, Nueva York). Ambas instalaciones están registradas en sus respectivos Departamentos de Salud locales y pasaron las inspecciones de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC (Centros para el Control de Enfermedades)) dentro del año de presentación de este manuscrito. Las instalaciones ABSL3 se operan de acuerdo con sus Manuales de Bioseguridad y Procedimientos Operativos Estándar, incluso para la contención de aerosoles biopeligrosos utilizando gabinetes de bioseguridad certificados y sistemas de ventilación sellados de las instalaciones que proporcionan un flujo de aire direccional sostenido, desde áreas limpias hacia áreas potencialmente contaminadas, y HEPA- escape filtrado. Los desechos biopeligrosos generados en las instalaciones se descontaminan por completo con desinfectantes aprobados, seguidos de esterilización en autoclave e incineración como desechos médicos regulados. El acceso a las instalaciones de ABSL3 está restringido al personal certificado y autorizado, inscrito en programas de vigilancia de la salud ocupacional y que use equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluidos respiradores aprobados por OSHA, protección para los ojos, overoles resistentes a derrames y guantes dobles. Cuando se analizaron fuera de las instalaciones de ABSL3, las muestras infecciosas se trataron minuciosamente utilizando métodos de inactivación examinados.

Todo el trabajo con aislamientos infecciosos de SARS-CoV-2 y virus recombinantes se realizó con la aprobación previa de los Comités Institucionales de Bioseguridad (IBC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland y la Facultad de Medicina Grossman de la NYU. Los CDC aprobaron los permisos de importación para las variantes aisladas del SARS-CoV-2. La generación de virus recombinantes SARS-CoV-2 para MF fue aprobada por el IBC (Comité Institucional de Bioseguridad) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland.

Los siguientes reactivos se obtuvieron a través de BEI Resources, NIAID, NIH (Institutos Nacionales de Salud): SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020, NR-52281, depositado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades; Coronavirus 2 relacionado con el SARS, aislado hCoV-19/Inglaterra/204820464/2020, B.1.1.7, NR-54000, aportado por Bassam Hallis; Coronavirus 2 relacionado con el SARS, aislado hCoV-19/Sudáfrica/KRISP-EC-K005321/2020 (NR-54008), aportado por Alex Sigal y Tulio de Oliveira; Coronavirus 2 relacionado con el SARS, aislado hCoV-19/Japón/TY7-503/2021 (Brasil P.1), NR-54982, aportado por el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, SARS-CoV-2 variante Delta, aislado hCoV19/EE.UU./ PHC658/2021, B.1.617.2, NR-55611. SARS-CoV-2 Omicron BA.1 (hCoV-19/USA/GA-EHC-2811C/2021, EPI_ISL_7171744) fueron proporcionados amablemente por Suthar Lab en Emory University. SARS-CoV-2 hCoV-19/USA/CA-Stanford-106_S04/2022 (Omicron BQ1.1, EPI_ISL_15196219) se obtuvo del Dr. Mehul Suthar (Emory University, Atlanta, Georgia, EE. UU.) y el Dr. Benjamin Pinsky (Stanford Universidad de Stanford, California, EE. UU.). El stock USA-WA1/2020 se produjo como se describió anteriormente80. Los otros virus SARS-CoV-2 se pasaron una vez en células Vero E6 suplementadas con 1 µg/ml de l-1-tosilamido-2-feniletil clorometil cetona (TPCK)-tripsina, para evitar la adaptación del virus a las células Vero E6 debido a la falta de expresión de TMPRSS2. Las células se infectaron a una MOI de 0,01 y se recogieron con un efecto citopático (CPE) del 50%. Después de la cosecha, el virus se purificó usando un colchón de sacarosa al 25 % a 25 000 RPM durante 3 a 4 h y se resuspendió usando PBS (solución salina tamponada con fosfato) antes de la infección. Para los stocks B.1.1.7, B.1.1.351 y P.1, las alícuotas se purificaron inicialmente en placa y se secuenciaron para verificar la firma variante antes de expandirse en presencia de TPCK-tripsina para generar un stock de trabajo del paso 1. Realizamos un paso de exclusión de desechos celulares mediante centrifugación de sobremesa antes de continuar con el paso de granulación de virus a través de un cojín de sacarosa. Luego, resuspendemos el sedimento en un volumen bajo, lo que da como resultado existencias de SARS-CoV-2 altamente concentradas y purificadas. WA-1 ΔORF6, WA-1ΔORF8 y su control WA-1 se generaron en el Laboratorio Frieman de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland61; Se usaron alícuotas según lo previsto para los experimentos. Para SARS-CoV-2 WA-1 inactivado por calor (HI), las reservas virales se incubaron a 56 ° C durante 5 h. Las muestras se titularon para confirmar la inactivación completa de las partículas infecciosas.

Los cachorros infectados como se describe anteriormente se sacrificaron de acuerdo con el procedimiento humanitario aprobado por IACUC a 2 dpi. La piel de las cabezas se eliminó suavemente para preservar las estructuras nasales. Luego se retiraron las cabezas y se sumergieron en PBS a 4 °C para un breve lavado, seguido de fijación en paraformaldehído al 4 % durante 72 h a 4 °C sin agitación. Luego, las cabezas se lavaron en PBS a 4 °C con agitación suave durante 20 min, seguido de descalcificación en una solución de EDTA 0,12 M a 4 °C con agitación suave durante 7 días. Luego, las cabezas intactas se procesaron a través de etanoles graduados hasta xileno y se infiltraron con parafina en un procesador de tejidos automatizado Leica Peloris. Las secciones incluidas en parafina se inmunoteñeron en un Leica BondRX, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las secciones desparafinadas se sometieron a una recuperación de calor de 20 minutos en tampón Leica ER2 (pH9, AR9640) seguido de Rodent Block (Biocare, RBM961 L) antes de una incubación de 1 h con el anticuerpo de proteína N SARS-CoV-2 (clon 1C7C7, Cell Signaling Technology, n.º de cat. 68344) a una dilución de 1:300 y un secundario de anti-ratón de cabra conjugado con AF594 (ThermoFisher, n.º de cat. A11005) a 1:100. Los portaobjetos se contrastaron con DAPI. La adquisición de imágenes semiautomática se realizó en un sistema de imágenes multiespectrales Vectra® Polaris. Después de escanear todo el portaobjetos a 20X, el tejido se contorneó manualmente para seleccionar campos para la separación espectral y el análisis de imágenes utilizando el software InForm® versión 2.6 de Akoya Biosciences. Los datos de imágenes de investigación se administraron con OMERO Plus v5.6 (Software Glencoe) para visualización, anotación y/o creación de figuras con OMERO.figure v 4.4 (equipo OME).

Se infectaron ratones adultos C57BL/6 J K18-hACE2+/- hemicigotos (13 semanas de edad, ambos sexos) con una dosis letal (10 000 UFP) del SARS-CoV-2 ancestral USA_WA-1/2020 a través de una infección intranasal de 10 μL bajo Anestesia con ketamina/xilazina. Los ratones machos y hembras se alojaron por separado en grupos de cuatro con un índice de infección de 1:3 respecto a la relación de contacto no infectado. El desprendimiento de virus se recogió sumergiendo las fosas nasales de cada ratón tres veces en medio viral (PBS más albúmina de suero bovino [BSA] al 0,3%) diariamente durante 10 días. La transmisión dentro de la jaula se determinó por la presencia de partículas infecciosas en ratones de contacto. Se puntuó el % de adquisición y se presentó como se describe a continuación. Los moribundos fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 seguida de dislocación cervical cuando se cumplieron los criterios de valoración humanitaria. A los 10 ppp, los animales supervivientes fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 seguida de punción cardíaca. Se realizaron lavados retrotraqueales de las vías respiratorias superiores de los animales supervivientes empujando 500 μL de PBS estéril a través de la tráquea y fuera de las fosas nasales. Se recogieron los pulmones y se homogeneizaron con perlas de acero inoxidable como se describe a continuación.

Para evaluar la seroconversión debida a la transmisión, se infectaron ratones adultos (de 13 semanas de edad) como se describe anteriormente y se alojaron por separado en grupos de índice de infección 1:3 y 1:2: contactos no infectados. Se inocularon ratones macho de 13 semanas con 10 μL de PBS estéril y ratones hembra de 12 semanas con una dosis subletal de 10 μL de SARS-CoV-2 USA_WA-1/2020 (1000 PFU). Se controló diariamente el peso y la supervivencia de los ratones. Tres semanas después de la infección, los animales fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 seguida de punción cardíaca. El lavado retrotraqueal de la URT y los homogeneizados de pulmón se recogieron como se describe anteriormente. La sangre se recogió mediante punción cardíaca utilizando una jeringa de insulina 28G1/2 de 1 ml y se añadió a un tubo de recogida de suero (BD Microtainer 365967). Los tubos se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente para facilitar la coagulación de la sangre y luego se centrifugaron a 4 °C durante 10 minutos (1500 × g). El suero se separó, se congeló a -80 °C y se analizó la presencia de anticuerpos IgG contra Spike Trimer (Acro Biosystems RAS-T023).

Los ratones neonatales se consideraron ratones de 4 a 7 días de edad. No se determinó el sexo de las crías individuales y, por lo tanto, probablemente se usaron animales de ambos sexos en todos los experimentos con ratones recién nacidos. Los cachorros se infectaron con un inóculo de PBS estéril de 3 μL sin anestesia general (para evitar la inoculación pulmonar directa) mediante instilación intranasal de 1500 UFP de SARS-CoV-2 WA-1, variante de SARS-CoV-2 o SARS-CoV-2 recombinante y regresó a la madre lactante durante la duración del experimento. En los experimentos de transmisión, uno o dos cachorros, como se indica en la leyenda de la figura, fueron infectados y devueltos a sus compañeros de camada (no infectados) durante la duración del experimento. La excreción de virus se recogió sumergiendo las fosas nasales de cada ratón tres veces en medio viral (PBS más albúmina de suero bovino [BSA] al 0,3 %) diariamente, y las muestras se evaluaron mediante transcripción inversa cuantitativa-PCR (RT-qPCR) o ensayo de placa. La transmisión dentro de la camada se evaluó mediante la recolección diaria de muestras de muda en los compañeros de camada (contacto). El % de adquisición se visualizó en diagramas de Kaplan-Meier invertidos. Los eventos de adquisición se calificaron como al menos dos días de títulos virales infecciosos en muestras de desprendimiento. El inicio de la adquisición se calificó como el primer día de detección del virus infeccioso. Las crías y la madre fueron sacrificadas mediante asfixia con CO2 seguida de punción cardíaca. El tracto respiratorio superior (URT) se sometió a un lavado retrotraqueal (lavado de 300 μL de PBS de la tráquea y recolección a través de las fosas nasales), y las muestras se usaron para cuantificar virus (mediante ensayo de placas o qRT-PCR). Las proporciones de índice a cachorros de contacto variaron de 1: 6-9 para la comparación de variantes a 1: 3-1: 4 para la optimización del modelo con WA-1.

Las extracciones de ARN se realizaron con el kit Qiagen QIAamp Viral RNA. El número de copias virales de N por µL se cuantificó mediante RT-qPCR utilizando el kit Taqman® RNA-to-CT One-Step RT-PCR (Applied BiosystemsTM) con cebadores y sonda de SARS-CoV-2 dirigidos a un amplicón en el N proteína del SARS-CoV-2 WA-1 (Adelante: 5'ATGCTGCAATCGTGCTACAA3'; reverso: 5' GACTGCCGCCTCTGCTC3') y la sonda 5'/56-FAM/TCAAGGAAC/ZEN/AACATTGCCAA/3IABkFQ/3'. Se generó una curva estándar para cada conjunto de datos utilizando la secuencia de ARN del SARS-CoV-2 N transcrita in vitro (MN985325.1).

Los títulos virales infecciosos se determinaron mediante ensayo de placas. En resumen, se añadieron diluciones de 10 veces de cada virus en DMEM + 1 % de antibiótico/antimicótico (Gibco) a una monocapa de células Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 durante 1 hora a 37 °C. Después de la incubación, las células se cubrieron con agarosa al 0,8 % en DMEM que contenía FBS al 2 % y se incubaron a 37 °C durante 36 horas. Las células se fijaron con formalina al 10 %, se retiró el tapón de agarosa y las placas se visualizaron mediante tinción con cristal violeta. Los stocks y muestras obtenidos de experimentos con ratones (desprendimiento, lavado y homogeneizados de pulmón) se titularon en Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2.

Los pulmones se recogieron en 500 µl de DPBS que contenía una perla de acero inoxidable (QIAGEN), se homogeneizaron con Tissue-Lyser II (QIAGEN) y los desechos se retiraron a 8000 rpm durante 8 min. Los títulos virales se determinaron mediante ensayo de placa utilizando células Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2.

Los niveles de citoquinas y quimioquinas se midieron en suero de ratón utilizando el ensayo Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex (Bio-Rad). Las citocinas y las quimiocinas se registraron en una máquina MAGPIX (Luminex) y se cuantificaron mediante comparación con una curva estándar. Para la recolección y análisis de datos se utilizó el software xPONENT versión 4.3.229.0. Usamos los límites de detección obtenidos experimentalmente para cada proteína y establecimos valores por debajo de ese límite de detección a un registro por debajo del límite. Todas las muestras se normalizaron con respecto a las de animales tratados con PBS. Los mapas de calor agrupados se generaron utilizando el paquete ComplexHeatmap v.2.14.0.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 9.5. Cada experimento se completó al menos dos veces independientes con duplicados biológicos internos a menos que se indique lo contrario en las leyendas de las figuras. Los datos se representan como la media geométrica ± desviación estándar geométrica (SD). Se realizaron pruebas de Kruskal-Wallis y de Mantel-Cox de rango logarítmico y se indicaron específicamente en las leyendas de las figuras. Solo los valores de p < 0,05 se mostraron en las figuras y los valores de p > 0,05 se consideraron no significativos (ns).

El número exacto de réplicas biológicas (n) es el siguiente:

Figura 1

índice b n = 4, contacto n = 9

índice c n = 4, contacto n = 9

índice d n = 4, contacto n = 9

e índice n = 4, contacto n = 9

fn = 1 ratón

Figura 2

bn = 8 para el desprendimiento longitudinal, n = 7 para el muestreo del día 2

cn = 15 para el desprendimiento longitudinal, n = 13 para el muestreo del día 2

dn = 7 para el desprendimiento longitudinal, n = 5 para el muestreo del día 2

en = 8 para el desprendimiento longitudinal, n = 6 para el muestreo del día 2

fn = 7 para el desprendimiento longitudinal, n = 5 para el muestreo del día 2

gn = 12 para el desprendimiento longitudinal, n = 5 para el muestreo del día 2

hn = 1 ratón por variante de SARS-CoV-2

figura 3

an = 12 para desprendimiento longitudinal, n = 12 para diagramas de Kaplan-Meier

bn = 27 para desprendimiento longitudinal, n = 27 para parcelas de Kaplan-Meier

cn = 14 para desprendimiento longitudinal, n = 14 para diagramas de Kaplan-Meier

dn = 15 para desprendimiento longitudinal, n = 15 para parcelas de Kaplan-Meier

en = 13 para desprendimiento longitudinal, n = 13 para parcelas de Kaplan-Meier

fn = 8 para desprendimiento longitudinal, n = 8 para diagramas de Kaplan-Meier

gn = 12 para desprendimiento longitudinal, n = 12 para diagramas de Kaplan-Meier

Figura 4

an = 7 para desprendimiento longitudinal, n = 5 muestreo del día 2

bn = 8 para desprendimiento longitudinal, n = 6 muestreo del día 2

cn = 10 para desprendimiento longitudinal, n = 8 muestreo del día 2

dn = 12 para desprendimiento longitudinal, n = 12 para parcelas de Kaplan-Meier

en = 14 para desprendimiento longitudinal, n = 14 muestreo del día 2

fn = 13 para desprendimiento longitudinal, n = 13 muestreo del día 2

gn = 19 para muestras de URT individuales (PBS n = 6, r-WA-1 n = 4, ORF6 n = 5, ORF8 n = 4), n = 21 para muestras de Pulmones individuales (PBS n = 6, r-WA- 1 n = 5, ORF6 n = 5, ORF8 n = 5)

hn = 1 ratón por variante de SARS-CoV-2

Figura complementaria 1

peso b: índice n = 3 (m = 2, f = 1), contacto n = 9 (m = 6, f = 3)

c curva de supervivencia: índice n = 3 (m = 2, f = 1), contacto n = 9 (m = 6, f = 3)

d desprendimiento longitudinal: índice n = 3 (m = 2, f = 1), contacto n = 9 (m = 6, f = 3)

e títulos pulmonares de punto final: contacto n = 9 (m = 6, f = 3)

f seroconversión (control y contacto): n = 11 (PBS n = 3 (m = 3), subletal n = 3 (f = 3), contactos n = 5 (m = 2, f = 3))

h peso: n = 12 (1500 UFP n = 6, 15000 UFP n = 3, 50000 UFP n = 3)

i eventos de mortalidad: n = 21 (1500 UFP n = 9, 15000 UFP n = 9, 50000 UFP n = 3)

j títulos longitudinales: n = 12 (1500 PFU n = 3, 15000 PFU n = 3, 50000 PFU n = 3)

k desprendimiento longitudinal: n = 11

Figura complementaria 2:

títulos de un compartimento longitudinal: día 1: n = 5, día 2: n = 7, día 3: n = 4

b títulos de compartimento longitudinal: día 1: n = 11, día 2: n = 13

títulos del compartimento c: día 1: n = 6

títulos de desprendimiento longitudinal d: n = 11

e títulos de compartimiento longitudinal: día 1: n = 5

fn = 1 ratón

Figura complementaria 3:

an = 12 para contactos, n = 2 para índice

bn = 27 para desprendimiento longitudinal, n = 4 para índice

cn = 14 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

dn = 15 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

en = 13 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

fn = 8 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

gn = 12 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

Figura complementaria 4:

an = 19 para muestras de URT individuales (PBS n = 6, r-WA-1 n = 4, ORF6 n = 5, ORF8 n = 4), bn = 21 para muestras de Pulmones individuales (PBS n = 6, r-WA- 1 n = 5, ORF6 n = 5, ORF8 n = 5)

Figura complementaria 5:

a r-WA-1 peso longitudinal: índice n = 4, contacto n = 16, supervivencia longitudinal (muertes): índice: n = 3, contacto n = 14

b ORF6 peso longitudinal: índice n = 2, contacto n = 14, supervivencia longitudinal (muertes): índice: n = 2, contacto n = 7

c ORF8 peso longitudinal: índice n = 2, contacto n = 13, supervivencia longitudinal (muertes): índice: n = 2, contacto n = 6

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados en este estudio se proporcionan en el archivo de información complementaria/datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

https://covariants.org.

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Agradecemos a Thomas M. Moran, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, y Luis Martínez-Sobrido, Texas Biomedical Institute, por el amable obsequio del anticuerpo monoclonal de ratón SARS-CoV N 1C7, y a Mehul Suthar, Emory School of Medicine, y Benjamin Pinsky, Universidad de Stanford, por el regalo de las variantes. Agradecemos a Ashley Fisher y Nicole Rondeau por su ayuda en el montaje del archivo de datos de origen. Agradecemos al Programa de Evaluación de la Evolución Viral (SAVE) del SARS-CoV-2 por sus aportes críticos a nuestros datos. La histopatología de la nasofaringe murina fue realizada por Mark Alu y Branka Brukner Dabovic del Laboratorio de Investigación de Patología Experimental de NYUMC (RRID: SCR_017928). Tanto el Laboratorio de Investigación de Patología Experimental como el Núcleo de Tecnología del Genoma de la NYU cuentan con el respaldo de la subvención P30CA016087 del Centro de Cáncer de la NYU y del Centro de Cáncer Laura e Isaac Perlmutter de NYU Langone, y el escáner multiespectral Vectra Polaris se compró a través de una Subvención de Instrumento Compartido S10 OD021747. También agradecemos al Programa de Patógenos Resistentes a los Antimicrobianos (AMR) Langone de la NYU y agradecemos a Adriana Heguy y al equipo del Núcleo de Tecnología del Genoma de la NYU por la secuenciación profunda de todos los virus utilizados en este estudio. La investigación fue financiada parcialmente por las siguientes subvenciones de NIH/NIAID: R01AI143639 a MD, K08AI141759 a MBO, R01AI143861 a KMK, DK093668 a KC y T32AI007180. Ninguno de los trabajos con el SARS-CoV-2 recombinante en la Escuela de Medicina Grossman de la NYU fue financiado por el NIAID. El trabajo fue apoyado además por el Instituto Vilcek de Ciencias Biomédicas para Graduados y por los fondos de puesta en marcha de la Escuela de Medicina Grossman de la NYU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Bruno A. Rodríguez-Rodríguez, Grace O. Ciabattoni.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Mila B Ortigoza, Meike Dittmann.

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Bruno A. Rodriguez-Rodriguez, Grace O. Ciabattoni, Ralf Duerr, Ana M. Valero-Jimenez, Stephen T. Yeung, Keaton M. Crosse, Austin R. Schinlever, Lucie Bernard-Raichon, Joaquin Rodriguez Galvan, Kamal M. Khanna, Mila B. Ortigoza & Meike Dittmann

Departamento de Medicina/División de Enfermedades Infecciosas e Inmunología, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Ralf Duerr, Ludovic Desvignes & Mila B. Ortigoza

Centro de Vacunas, NYU Grossmann of Medicine, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Ralf Duerr

Departamento de Microbiología e Inmunología, Centro de Investigación de Patógenos, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, MD, 21201, EE. UU.

Marisa E. McGrath y Matthew B. Frieman

Departamento de Biología Sintética y Bioenergía, Instituto J. Craig Venter, Rockville, MD, 20850, EE. UU.

Sanjay Vashee y Yong Xue

Departamento de Patología, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Cynthia A. Loomis

Centro de Cáncer Perlmutter, Universidad de Nueva York Langone Health, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Kamal M Khanna

División de Gastroenterología y Hepatología, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Ken Cadwell

Departamento de Farmacología de Sistemas y Terapéutica Traslacional, Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Ken Cadwell

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pennsylvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Ken Cadwell

Laboratorios de alta contención - Oficina de ciencia e investigación, NYU Langone Health, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Ludovico Desvignes

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Correspondencia a Mila B. Ortigoza o Meike Dittmann.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Nicole M. Bouvier y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Rodríguez-Rodríguez, BA, Ciabattoni, GO, Duerr, R. et al. Un modelo de ratón neonatal caracteriza la transmisibilidad de las variantes de SARS-CoV-2 y revela un papel para ORF8. Nat Comun 14, 3026 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38783-0

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Recibido: 21 de octubre de 2022

Aceptado: 15 de mayo de 2023

Publicado: 25 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38783-0

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